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  • 抗c-Met激動劑抗體及其應用的制作方法

    文檔序號:26100122發布日期:2021-07-30 18:10
    抗c-Met激動劑抗體及其應用的制作方法

    本申請對于2018年12月7日提交的大韓民國專利申請第10-2018-0157355號提出優先權請求,所述說明書全部作為本申請的參考文獻。

    本發明涉及抗c-met激動劑抗體及其應用,更具體來說,涉及與人源c-met蛋白質特異性結合的激動劑抗體或其片段、其生產方法、使用其的c-met特異性檢測方法、包含其的癌的預防或治療用組合物、干細胞的分化誘導用組合物以及干細胞用培養基。



    背景技術:

    c-met作為存在于細胞表面的代表性的rtk(受體酪氨酸激酶),不僅與作為其配體的hgf/sf(肝細胞生長因子/離散因子)結合而促進細胞內信號傳遞,促進細胞的生長,而且在多種癌細胞中過表達,廣泛地參與癌的發生、癌轉移、癌細胞的遷移、癌細胞的浸潤、血管生成。此外,如配體這一名稱所指,介以hgf/sf的c-met信號傳遞減弱幾乎所有種類的上皮性腫瘤(epithelialtumor)的細胞間接觸(cell-cellcontact),是引發離散的代表性的癌轉移初期的蛋白質(natrevcancer.2012jan24;12(2):89-103)。特別是眾所周知c-met基因的上游(upstream)存在缺氧應答元件(hypoxiaresponse),該基因的表達在缺氧狀況下增加(oraloncol.2006jul;42(6):593-8)。此外,c-met在從發生起經發展至轉移為止的癌發生的各步驟均發揮作用,因此c-met及作為其配體的hgf一直以來被視作用于癌靶向治療的優先候選位點([comoglio等2008natrevdrugdiscov7:504];[knudsen和vandewoude2008curropingenetdev18:87])。特別是已知目前人們所知的抗癌劑的作用機理涉及抗藥性,所以c-met在個性化治療中的重要性進一步被認識,成為關于抗癌劑受到大量制藥公司關注的靶分子。

    最近,針對c-met的抗體作為拮抗藥(antagonist)在抗癌劑的開發中取得了少許進展,但是需要開發對于c-met具有更高的親和性而可特異性結合、由人源序列構成、給藥至體內時誘發免疫反應的可能性低、顯示更多樣的活性的c-met。



    技術實現要素:

    技術課題

    于是,本發明人努力進行靶向c-met并顯示多樣的生理活性的抗體的開發后,確認為了靶向c-met而由特異性結合c-met的人源互補決定區(cdr)和骨架區(fr)形成的人抗體顯示與hgf類似的活性,發揮與作為細胞表面分子的c-met結合而誘導信號傳遞的激動劑抗體的功能,從而完成了本發明。

    因此,本發明的目的是提供與人源c-met蛋白質特異性結合的激動劑抗體或其片段。

    本發明的另一目的是提供編碼所述抗體或其片段的聚核苷酸、載體、以及被載體轉化的細胞。

    本發明的又另一目的是提供與人c-met結合的激動劑抗體或其片段的生產方法、以及c-met特異性檢測方法。

    本發明的又另一目的是提供包含所述抗體或其片段作為有效成分的癌的預防或治療用藥學組合物。

    此外,本發明的又另一目的是提供由所述抗體或其片段形成的預防或治療用藥學組合物。

    此外,本發明的又另一目的是提供以所述抗體或其片段必須的癌的預防或治療用藥學組合物。

    本發明的又另一目的是提供包含所述抗體的干細胞的分化誘導用組合物以及包含其的干細胞用培養基。

    此外,本發明的又另一目的是提供由所述抗體形成的干細胞的分化誘導用組合物以及包含其的干細胞用培養基。

    此外,本發明的又另一目的是提供以所述抗體必須的干細胞的分化誘導用組合物以及包含其的干細胞用培養基。

    本發明的又另一目的是提供所述抗體或其片段在癌的預防或治療用制劑的制造中的用途。

    本發明的又另一目的是提供癌的治療方法,其中,包括將有效量的包含所述抗體或其片段作為有效成分的組合物給予有需要的個體的步驟。

    本發明的又另一目的是提供所述抗體在干細胞的分化誘導用制劑的制造中的用途。

    本發明的又另一目的是提供干細胞的分化誘導方法,其中,包括將有效量的包含所述抗體的組合物給予有需要的個體的步驟。

    解決技術問題所采用的技術方案

    為了實現如上所述的目的,本發明提供一種與人源c-met蛋白質特異性結合的激動劑抗體或其片段,其中,所述抗體包含抗體輕鏈可變區(vl)和抗體重鏈可變區(vh),所述抗體輕鏈可變區(vl)包括含有以序列編號1所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)l1、含有以序列編號2所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)l2和含有以序列編號3所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)l3,所述抗體重鏈可變區(vh)包括含有以序列編號4所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)h1、含有以序列編號5所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)h2和含有以序列編號6所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)h3。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種編碼所述抗體或其片段的聚核苷酸。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種包含所述聚核苷酸的載體。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種通過所述載體被轉化的細胞。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種與人c-met結合的激動劑抗體或其片段的生產方法,其中,包括:在將所述細胞在表達聚核苷酸的條件下進行培養,生產包含輕鏈及重鏈可變區的多肽的步驟;以及從所述細胞或對其進行培養的培養基回收所述多肽的步驟。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種c-met特異性檢測方法,其中,包括使所述抗體或其片段與試樣接觸的步驟以及檢測所述激動劑抗體或其片段的步驟。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種包含所述抗體或其片段作為有效成分的癌的預防或治療用藥學組合物。

    此外,本發明提供一種由所述抗體或其片段形成的癌的預防或治療用藥學組合物。

    此外,本發明提供一種以所述抗體或其片段為必要成分的癌的預防或治療用藥學組合物。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種包含所述抗體的干細胞的分化誘導用組合物。

    此外,本發明提供一種由所述抗體形成的干細胞的分化誘導用組合物。

    此外,本發明提供一種為所述抗體必須的干細胞的分化誘導用組合物。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種包含所述組合物的干細胞用培養基。

    此外,本發明提供一種由所述組合物形成的干細胞用培養基。

    此外,本發明提供一種為所述組合物為必須的干細胞用培養基。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種所述抗體或其片段在癌的預防或治療用制劑的制造中的用途。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種癌的治療方法,其中,包括將有效量的包含所述抗體或其片段作為有效成分的組合物給予有需要的個體的步驟。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種所述抗體在干細胞的分化誘導用制劑的制造中的用途。

    為了實現本發明的另一目的,本發明提供一種干細胞的分化誘導方法,其中,包括將有效量的包含所述抗體的組合物給予有需要的個體的步驟。

    以下,對本發明進行詳細說明。

    本發明提供一種與人源c-met蛋白質特異性結合的激動劑抗體或其片段,其中,所述抗體包含抗體輕鏈可變區(vl)和抗體重鏈可變區(vh),所述抗體輕鏈可變區(vl)包括含有以序列編號1所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)l1、含有以序列編號2所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)l2和含有以序列編號3所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)l3,所述抗體重鏈可變區(vh)包括含有以序列編號4所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)h1、含有以序列編號5所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)h2和含有以序列編號6所示的氨基酸序列的互補決定區(cdr)h3。

    本發明的“c-met蛋白質”是肝細胞生長因子(hgf)的受體,hgf是與c-met受體酪氨酸激酶的細胞外部位結合并在各種正常細胞和腫瘤細胞中誘發分裂、運動、形態發生、血管生成的細胞因子的一種。c-met是存在于細胞表面的代表性的受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase),其本身是致癌基因,有時與作為配體的hgf無關,是與癌的發生、癌轉移、癌細胞的遷移、癌細胞浸潤、血管生成等涉及腫瘤的各種機理相關的蛋白質。所述蛋白質包括由以序列編號7(ncbi參考序列:nm_001127500.2)表示的核苷酸序列(mrna)編碼的多肽或其細胞外結構域,也是具有以序列編號8(ncbi參考序列:np_001120972.1)表示的氨基酸序列的多肽。

    本發明的“抗體”、“抗c-met抗體”、“人源化抗c-met抗體”和“變形人源化抗c-met抗體”、“anti-c-metantibody”以本發明的最廣義的含義使用,具體來說,單克隆性抗體(包括單克隆抗體、全長單克隆抗體)、多克隆性抗體(多克隆抗體)包括多重特異性抗體(例如,雙重特異性抗體)、及抗體的片段(例如,可變區和顯示作為目標的生物活性(例如,與c-met的結合)的抗體的其他部分)。

    本發明的抗體作為為了可與c-met選擇性結合而在輕鏈及重鏈cdr中包含特定的氨基酸序列的抗體,其中均包括單克隆抗體和多克隆抗體,較好是可以為單克隆抗體。此外,本發明的抗體均包括嵌合抗體、人源化抗體、人抗體,較好是可以為人抗體。

    本發明的單克隆抗體表示由實質上同質的抗體的群體獲得的抗體。即,除了可少量存在的盡可能天然存在的突變之外,構成群體的各抗體相同。單克隆抗體非常特異性地與單一性抗原的表位結合。

    本發明中,“單克隆”一詞是指抗體由實質上同源性的群體獲得并表示抗體的特性,并不是必須通過特定的方法生產抗體。例如,本發明的單克隆抗體可通過最先記載于文獻(kohler等(1975)nature256:495))的雜交瘤法制造,或者可通過重組dna方法(參照:美國專利第4,816,567號)制造。此外,例如可使用本領域公知的技術從噬菌體抗體文庫中分離。

    本發明的抗體具體包括嵌合抗體,嵌合抗體的情況下,重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定的種,或者與特定抗體的相應序列一致或顯示同源性,只要本發明的抗體顯示所期望的生物學活性(例如,與nrs的選擇性結合),其余部分可源自其他種,或者與其他抗體的相應序列一致或顯示同源性(美國專利第4,816,567號)。

    人源化抗體是人和非人(例如,小鼠、大鼠)抗體的序列全部包含在內的抗體,一般來說,除與表位結合的部位(cdr)以外的其余部分為人抗體的序列,與表位結合的部位(cdr)可包含非人源序列。全人抗體是指僅包含人免疫球蛋白的蛋白質序列的抗體,可由小鼠、小鼠細胞或來源于小鼠細胞的雜交瘤生產,或者通過噬菌體展示法生產。

    由生物體生產的天然抗體通常是由2條同樣的輕鏈(l)和2條同樣的重鏈(h)構成的約150,000道爾頓的異源四聚體性糖蛋白。各輕鏈通過1個共有二硫鍵與重鏈連接,但二硫鍵數在不同的免疫球蛋白亞型的重鏈之間以不同的形式存在。各重鏈和輕鏈還具有規律地間隔的鏈內二硫鍵交聯。各重鏈在一末端具有與可變結構域(vh)相連的多個恒定結構域。各輕鏈在一末端具有可變結構域(vl),在另一末端具有恒定結構域,輕鏈的恒定結構域與重鏈的第一恒定結構域對位,輕鏈的可變結構域與重鏈的可變結構域對位。被認為是特別的氨基酸殘基在輕鏈可變結構域與重鏈可變結構域間形成界面??贵w的“可變區”或“可變結構域”是指抗體的重鏈或輕鏈的氨基酸末端結構域。重鏈的可變區記作“vh”,輕鏈的可變區記作“vl”。這些結構域一般來說是抗體的最具可變性的部分,包括抗原結合部位。

    本發明中,“高變性(hypervariable)”是指所述可變區內的若干序列在抗體間的序列上大范圍變化,包含與針對其特異性的抗原決定簇的各特定抗體的結合和特異性直接相關的殘基。輕鏈及重鏈可變區這兩者中,高變性的關注點集中于作為互補決定區(cdr)或高變環(hvl)公知的3個區段。cdr由基于文獻(kabat等、1991年、in:sequencesofproteinsofimmunologicalinterest、5thed.publichealthservice、nationalinstitutesofhealth、bethesda、md)的序列比對限定,而hvl如文獻(chothia和le、1987、j.mol.biol.196:901-917)所揭示基于所述可變區的三維結構在結構上限定。

    分別在所述重鏈和輕鏈內的3個cdr被骨架區(fr)分隔,所述部位包含具有以下的可變傾向的序列。從所述重鏈及輕鏈可變區的氨基末端至羧基末端,所述fr和cdr以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4的順序排列。所述fr的較大的β折疊結構使所述各鏈內部的cdr不僅相互接近,也與其他鏈的cdr接近。所生成的形態有利于抗原結合部位,但不需要所有cdr殘基都直接參與與抗原的結合。

    本發明的所述片段的特征在于,選自雙抗體、fab、fab'、f(ab)2、f(ab')2、fv和scfv。

    本發明的抗體的片段是指維持抗體整體的抗原特異性結合能力的抗體的片段,較好是所述片段保持母抗體的人源c-met蛋白質親和性的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或其以上。具體來說,還可以是fab、f(ab)2、fab'、f(ab')2、fv、雙抗體、scfv等形態。

    fab(fragmentantigen-binding)為抗體的抗原結合片段,由重鏈和輕鏈各自的一個可變結構域和恒定結構域構成。f(ab')2為將抗體用胃蛋白酶水解生成的片段,呈2個fab介以重鏈鉸鏈(hinge)通過二硫鍵(disulfidebond)連接的形態。f(ab')為將f(ab')2片段的二硫鍵還原而分離得到的fab上附加有重鏈鉸鏈的形態的單體的抗體片段。fv(variablefragment,可變片段)為僅由重鏈和輕鏈各自的可變區構成的抗體片段。scfv(singlechainvariablefragment,單鏈可變片段)為重鏈可變區(vh)和輕鏈可變區(vl)通過柔軟的肽接頭連接的重組抗體的片段。雙抗體(diabody)是指scfv的vh和vl以極短的接頭連接而無法相互結合,與具有相同形態的其他scfv的vl和vh分別結合而形成二聚體的形態的片段。

    本發明的目標抗體的片段只要維持針對人源c-met蛋白質的結合特異性,結構和形態不受限制,但較好是可以為scfv。本發明所述的scfv只要具有對于所述人源c-met蛋白質特異性的cdr的構成、或者vh和vl的構成,vh的c末端與vl的n末端介以接頭連接,其序列無特別限定。所述接頭只要作為在本領域中適用于scfv的接頭公知,其種類無特別限定。

    本發明的抗體或其片段可包含實質上不改變其生物學活性的保守性氨基酸置換(也稱為抗體的保守性變異體)。

    此外,上述的本發明的抗體或其片段有時也與酶、熒光物質、放射性物質和蛋白質等結合,對其無限定。此外,抗體的結合所述物質的方法在本領域是公知的。

    本發明的抗體可來源于包括包含人的哺乳動物、鳥類等的任意動物。所述抗體較好是人、小鼠、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的抗體,最好是人或小鼠。

    人抗體還包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列,且從人免疫球蛋白文庫分離的抗體,或者從針對一種以上人免疫球蛋白進行轉化移植而不表達內源性免疫球蛋白的動物分離的抗體(參照美國專利第5,939,598號)。

    本發明的抗體有時也可以是與酶、熒光物質、放射性物質和蛋白質等結合的抗體,對其無限定。此外,抗體的結合所述物質的方法在本領域是公知的。

    本發明提供一種編碼所述抗體或其片段的聚核苷酸。

    本發明中,“聚核苷酸”也可記載為寡聚核苷酸或核酸,包括dna分子(例如,cdna或基因組(基因組dna))、rna分子(例如,mrna)、使用核苷酸類似物生成的所述dna或rna的類似物(例如,肽核酸和非自然產生的核苷酸類似物)和它們的雜合體。所述聚核苷酸可以是單鏈(single-stranded)或雙鏈(double-stranded)。所述聚核苷酸是指編碼由具有對所述krs的n末端區域特異性的cdr的構成、或者vh和vl的構成的重鏈和輕鏈形成的抗體的堿基序列。

    本發明的聚核苷酸只要編碼本發明的抗體或其片段,其序列無特別限定,編碼以上說明的本發明所述的抗體中所述的cdr序列的聚核苷酸的序列無特別限定,較好是包含以序列編號1(重鏈cdr1)、序列編號2(重鏈cdr2)、序列編號3(重鏈cdr3)、序列編號4(輕鏈cdr1)、序列編號5(輕鏈cdr2)、序列編號6(輕鏈cdr3)表示的堿基序列。此外,本發明所述的抗體中,編碼上述的vh和vl的聚核苷酸的序列無特別限定。

    編碼本發明的述抗體或其片段的聚核苷酸可通過本領域公知的方法獲得。例如,可基于編碼所述抗體的重鏈和輕鏈的部分或全部的dna序列或其氨基酸序列,使用本領域熟知的寡核苷酸合成方法、例如聚合酶鏈式反應(pcr)法等合成。

    本發明提供一種含有所述多聚核苷酸的載體。

    本發明的“載體(vector)”用于為了本發明的抗體或其片段的重組生產而進行的本發明的聚核苷酸的復制或表達,一般來說,包含信號序列、復制起點、1個以上的標記物基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列中的一種以上。本發明的載體較好是可以為表達載體,更好是可以為包含以可作用的方式與調節序列、例如啟動子的本發明的聚核苷酸的載體。

    作為載體的一種的質粒是指可結合外源聚核苷酸片段的線性或環形的雙螺旋dna分子。載體的其他形態為病毒載體(viralvector,例如復制缺陷型逆轉錄病毒(replicationdefectiveretroviruses)、腺病毒和腺伴隨病毒(adenoassociatedviruses)),在此附加的dna片段可引入所述病毒基因組(viralgenome)內。特定的載體可在其中導入這些載體的宿主細胞(例如,包括來源于細菌(bacterialorigin)的載體和附加型哺乳類載體(episomalmammalianvectors)的細菌性載體(bacterialvectors))內進行自我復制。其他載體(例如,非附加型哺乳類載體(non-episomalmammalianvectors))通過導入宿主細胞內,被整合至宿主細胞的基因組內,并且由此與所述宿主細胞基因組一起被復制。

    本發明中,“表達載體(expressionvector)”為可表達所選擇的聚核苷酸的載體的一種形態。一種聚核苷酸序列在調節序列對所述聚核苷酸序列的表達(例如,水平、時機或表達的位置)產生影響的情況下,“以可作用的方式連接于”所述調節序列(regulatorysequence)。所述調節序列是以其可作用的方式連接的對核酸的表達(例如,水平、時機或表達的位置)產生影響的序列。所述調節序列例如可對于所調節的核酸直接或通過一種以上的其他分子(例如,與所述調節序列和/或所述核酸結合的多肽)的作用,產生影響。所述調節序列包括啟動子、增強子、和其他表達條件元件。本發明的載體較好是可以為poptivectm-topo和pcdnatm3.3-topo。

    本發明提供一種通過所述載體被轉化的細胞。

    本發明的細胞只要是可用于本發明的表達載體所含的編碼所述抗體或其片段的聚核苷酸的表達的細胞,其種類無特別限定。通過本發明所述的表達載體轉化的細胞(宿主細胞)可以是原核細胞(例如,大腸桿菌)、真核細胞(例如,酵母或其他菌類)、植物細胞(例如,煙草或西紅柿植物細胞)、動物細胞(例如,人細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞、昆蟲細胞)、或者來源于它們的雜交瘤。較好是來源于包含人的哺乳類的細胞。

    適合于本目的的原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性的有機體,例如腸道細菌科(enterobacteriaceae)、例如埃希氏菌屬(escherichia)、例如大腸桿菌(e.coli)、腸桿菌屬(enterobacter)、歐文氏菌屬(erwinia)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、變形桿菌屬(proteus)、沙門氏菌屬(salmonella)、例如鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(serratia)、例如粘質沙雷氏菌(serratiamarcescans)、和痢疾志賀氏菌(shigella)、和芽孢桿菌屬(bacilli)、例如枯草芽孢桿菌(b.subtilis)及地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)、假單胞菌屬(pseudomonas)、例如綠膿桿菌(p.aeruginosa)、和鏈霉菌屬(streptomyces)。本發明的細胞只要可以表達本發明的載體,無特別限定,較好是大腸桿菌。

    作為本發明的細胞,真核細胞最常采用酵母(釀酒酵母(saccharomycescerevisiae))。另一方面,還可使用多種其他屬、種和菌株,例如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、克魯維酵母宿主、例如乳酸克魯維酵母(k.lactis)、脆壁克魯維酵母(k.fragilis,atcc12,424)、保加利亞克魯維酵母(k.bulgaricus)(atcc16,045)、威克拉姆氏克魯維酵母(k.wickeramii)(atcc24,178)、瓦特氏克魯維酵母(k.waltii)(atcc56,500)、果蠅克魯維酵母(k.drosophilarum)(atcc36,906)、耐熱克魯維酵母(k.thermotoierans)及馬克斯克魯維酵母(k.marxianus),耶氏酵母屬(yarrowia)(ep402,226),巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)(ep183,070),念珠菌屬,瑞氏木霉菌(trichodermareesia)(ep244,234),粗糖脈抱菌(neurosporacrasssa),許旺氏酵母屬(schwann1myces)、例如西方許旺氏酵母(schwann1mycesoccidentalis)和絲狀真菌、例如脈孢屬(neurospora)、青霉屬(penicillium)、彎頸霉屬(tolypocladium),和曲霉屬(aspergillus)宿主、例如小巢狀曲霉(a.nidulans)及黑曲霉(a.niger),但并不僅限于。

    所述術語“轉化(transformation)”是指基于外源性聚核苷酸的引入的宿主細胞的基因型的變化,無關用于該轉化的方法,均指外源性聚核苷酸被引入宿主細胞內。被引入宿主細胞內的外源性聚核苷酸可整合于宿主細胞的基因組內并維持,或者不整合的情況下維持,本發明同時包含兩者。

    本發明涉及的可表達與人源c-met蛋白質特異性結合的抗體或片段的重組表達載體可為了生產抗體或其片段而通過本領域公知的方法引入細胞內部而進行轉化,所述方法可例舉例如瞬時轉染(transienttransfection)、微注射、轉導(transduction)、細胞融合、磷酸鈣沉淀法、脂質體介導轉染(liposome-mediatedtransfection)、deae葡聚糖介導轉染(deaedextran-mediatedtransfection)、聚凝胺介導轉染(polybrene-mediatedtransfection)、電穿孔法、基因槍(genegun)和用于將核酸導入細胞內的公知的方法,但并不僅限于此。

    此外,本發明的細胞為可通過本發明的聚核苷酸或包含其的載體轉化或轉染的培養細胞,該細胞可持續在所述宿主細胞內表達。重組細胞是指被要表達的聚核苷酸轉化或轉染的細胞。本發明的細胞還可以是包含本發明的聚核苷酸,但只要調節序列以與所述聚核苷酸通過可作用的形式連接的方式導入所述細胞內,不會表達該聚核苷酸至所期望的水平的細胞。

    本發明的細胞可通過各種培養基進行培養。商業上可采用的培養基、例如漢姆氏(ham's)f10(西格瑪奧德里奇公司,圣路易斯,密蘇里州)、伊格爾最低必需培養基(mem,西格瑪奧德里奇公司)、rpmi-1640(西格瑪奧德里奇公司)、和達爾伯克改良伊格爾培養基(dmem,西格瑪奧德里奇公司)適合于細胞的培養。所述培養基可根據需要追加激素和/或其他生長因子、鹽、緩沖液、核苷酸、抗生素、微量元素和葡萄糖、或者同等的能量源。

    本發明提供一種與人c-met結合的激動劑抗體或其片段的生產方法,其中,包括:在將所述細胞在表達聚核苷酸的條件下進行培養,生產包含輕鏈及重鏈可變區的多肽的步驟;以及從所述細胞或對其進行培養的培養基回收所述多肽的步驟。

    本發明中,關于生產方法中的細胞如前所述,包含編碼本發明的抗體的聚核苷酸。所述生產方法的多肽可以是本發明的抗體或其片段本身,也可另外結合有除本發明的抗體或其片段以外的其他氨基酸序列。

    該情況下,可利用本領域一般技術人員熟知的方法,從本發明的抗體或其片段除去。所述培養的培養基組成和培養條件可根據所述細胞的種類而變化,這可由本領域一般技術人員適當地進行選擇和調節。

    所述抗體分子可積聚于細胞的細胞質內、或者從細胞分泌、或者通過適當的信號序列以周質或細胞外培養基(supernatant)靶向化,較好是靶向周質或細胞外培養基。此外,較好是利用本領域一般技術人員熟知的方法使所生產的抗體分子折疊,使其具有功能性構象(conformation)。所述多肽的回收可根據所生產的多肽的特性和細胞的特性而不同,其可由具有本領域常識的人適當地進行選擇和調整。

    所述多肽可生產至細胞內、周邊細胞質的空間,或者直接分泌至培養基內。多肽在細胞內生產的情況下,該細胞可作為第一步驟被破壞而釋放蛋白質。粒子型碎片、宿主細胞或被溶解的片段可通過例如離心分離或超濾被除去??贵w被分泌至培養基內的情況下,來自這樣的表達系統的上清液通常最初用可商業化利用的蛋白質濃縮過濾器、例如amicon或milliporepellicon超濾單元進行濃縮??蔀榱艘种频鞍踪|分解在任意的在先步驟包含蛋白酶抑制劑、例如pmsf,也可為了防止偶發的污染物質的增長而包含抗生素。由細胞制造的抗體可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析進行純化,本發明的抗體較好是通過親和層析進行純化。

    本發明提供一種c-met特異性檢測方法,其中,包括使所述抗體或其片段與試樣接觸的步驟以及檢測所述激動劑抗體或其片段的步驟。

    本發明的所述檢測方法在使本發明所述的抗體或其片段與試樣接觸之前,可包括使用本發明所述的抗體或其片段準備用于測定krs(或暴露于細胞外膜的krs的n末端肽)的有無和濃度的試樣的步驟((1)步驟)。

    一般技術人員可適當選擇利用抗體檢測蛋白質的公知方法,根據選擇的方法準備試樣。此外,試樣可以是以從診斷癌或癌轉移的程度的被檢測體采集的活體標本等得到的細胞或組織、血液、全血、血清、血漿、唾液、腦脊液等。使用所述抗體檢測蛋白質的方法無限定,有例如蛋白質印跡、免疫印跡、斑點印跡法、免疫組化學染色(immunohistochemistry)、酶聯免疫測定(elisa)、放射免疫測定法(radioimmunoassay)、競爭性結合分析、免疫沉淀等。例如,為了實施蛋白質印跡,可通過向試樣或細胞的溶解產物添加適合于電泳的緩沖液并煮沸等方法進行準備,為了免疫組化學染色,進行固定細胞或組織的切片并封閉(blocking)等預處理。

    接著,實施使本發明所述的抗體或其片段與上述的步驟中準備的試樣接觸的步驟((2)步驟)。

    本發明所述的抗體是具有以上所述的cdr、或vh和vl的構成且與人源c-met蛋白質特異性結合的抗體或其片段,關于其具體的種類和序列的構成如上所述。

    為了上述檢測,所述抗體或其片段一般可通過能夠檢測的部分(moiety)進行標記。例如,可使用本領域公知的技術通過放射性同位素或熒光標記進行標記。此外,可利用各種各樣的酶-底物標記,作為所述酶標記的例子,包括如果蠅熒光素酶和細菌熒光素酶(美國專利第4,737,456號)等熒光素酶、熒光素(luciferin)、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、如辣根過氧化物酶(hrpo)等過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如,葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(例如,尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。使酶與抗體結合的技術在本領域是公知的。標記可利用各種公知的技術,與抗體直接或間接結合。例如,抗體可與生物素(biotin)結合,屬于所述3大類的任意標記可與親和素(avidin)結合,或者相反地與其結合。生物素與親和素選擇性結合,所以該標記可通過這樣的間接方法結合于抗體?;蛘?,為了實現抗體的標記的間接結合,抗體可與較小的半抗原(hapten)(例如,地高辛[digoxin])結合,所述的不同類型的標記之一可與抗半抗原抗體結合(例如,抗地高辛抗體)。因此,可實現標記對于抗體的間接結合。

    本發明中,“接觸(contacting)”以其通常的含義使用,是指將2種以上的物質混合、結合、或相互連接。所述接觸可在試管內(invitro)或其他容器中實施,還可在原位(insitu)、生物體內、個體內、組織內、細胞內進行。

    接著,通過實施所述(2)步驟后的試樣檢測本發明所述的抗體或其片段的步驟((3)步驟)。

    所述“檢測”以試樣內形成的本發明所述的抗體或其片段與抗原的復合物為對象,感知人c-met的肽(或包含其的蛋白質)是否存在或測定所述肽的水平(定性或定量的測定均包含在內)。因此,在進行所述(2)步驟之后、后述的檢測步驟((3)步驟)之前,還包括除去未與人源c-met蛋白質形成復合物的剩余抗體或其片段的步驟。

    在上述的(2)步驟所使用的抗體或其片段包含以熒光、放射性同位素、酶等直接標記等的可檢測的部分(moiety)的情況下,可通過檢測該部分的本領域公知的方法進行。作為一例,放射能例如可通過閃爍計數(scintillationcounting)進行測定,熒光可用熒光計進行定量。

    此外,在上述的(2)步驟所使用的抗體或其片段不包含以上單獨說明的檢測部分情況下,如本領域所知,可使用以熒光、放射能、酶等標記的二級抗體間接地進行感知。所述二級抗體與基于本發明的抗體或其片段(一級抗體)結合。

    最近的研究中,報道有關于hgf/sf也作用于神經系統,特別是涉及運動神經細胞的保護功能的大量研究(novak等、journalofneuroscience20:326-337、2000)。此外,還提示在心臟的損傷恢復(nakamura等、jclininvest.106:1511-1519、2000)等通常的臟器損傷后的防御、生理學機理也有重要的作用,實際上已證明hgf/met路徑與腦梗塞、進行性腎炎、肝硬化和肺纖維化的過程相關,hgf在這些變性疾病的病變中過表達,通過組織損傷的生理學防御機制顯示保護活性(comoglio等、naturereviewdrugdiscovery7:504-516、2008)。此外,hgf/c-met信號傳遞的過度活性與內皮系統的各種細胞的惡性腫瘤化和血管生成相關,基于這樣的觀點,提示了靶向c-met的拮抗性c-met抗體可用作抗癌劑的可能性(comoglio等、naturereviewdrugdiscovery.7:504-516、2008)。例如,報道了具有一個分支的c-met抗體對hgf的基于c-met二聚體化的激活進行負調節,移植小鼠模型中有效地抑制腫瘤的生長(jin等、cancerresearch68(11):4360-4368、2008;comoglio等、naturereviewdrugdiscovery.7:504-516、2008)。此外,t細胞治療法中,對于選擇性識別癌細胞的表面抗原的t細胞的基因操作,針對癌細胞所過表達的抗原的抗體也被應用至用于連接t細胞的腫瘤靶向化(sadelain、thecancerjournal15(6):451-455、2009)。

    本發明提供一種包含所述抗體或其片段作為有效成分的癌的預防或治療用藥學組合物。

    本發明的所述抗體及其片段的與所述c-met蛋白質特異性結合的能力良好,c-met抗體或其片段具有對hgf的激活進行負調節而抑制腫瘤生長的效果,因此可用作癌治療劑。此外,所述抗體或其片段組合癌治療藥,可用于癌的預防和治療,可將所述抗體或片段與藥學上可接受的載體一起制成合適的形態而用于癌的預防或治療。

    本發明的所述“癌(cancer)”可包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管癌、結腸/直腸癌、大腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、膽囊癌、前列腺癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、纖維肉瘤、急性骨髓性白血病、成人t細胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、黑色素瘤、間皮細胞瘤、維爾姆斯瘤、和透明細胞肉瘤(ccs)、腺泡狀軟組織肉瘤(asps)和電位相關腎細胞癌,但并不僅限于此。

    本發明所述的藥學組合物可單獨含有與c-met蛋白質特異性結合的激動劑抗體或其片段,也可與藥學上可接受的載體一起制劑化成適當的形式,可追加含有賦形劑或稀釋劑。上述中,“藥學上可接受”是指生理學上允許,向人給藥時,通常不會引發腸胃障礙、頭暈等過敏反應或與之類似的反應的無毒性的組合物。

    作為藥學上可接受的載體,例如可還包含口服用載體或非口服用載體??诜幂d體可包括乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。同時,可包含用于肽制劑的口服的各種藥物遞送物質。此外,非口服用載體可包含水、適當的油、食鹽水、水性葡萄糖和二醇等,可還包含穩定劑和保存劑。作為合適的穩定劑,有亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、或如抗壞血酸等抗氧化劑。作為合適的保存劑,有苯扎氯銨、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯和氯丁醇。除上述成分之外,本發明的藥學組合物可還包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑等。其他藥學上可接受的載體和制劑可參照本領域公知的載體或制劑。

    本發明的組合物可通過任意的方法給予人等哺乳動物。例如,可通過口服或非口服的方式給藥。作為非口服的給藥方法,可以是靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、硬腦膜內、心臟內、經皮、皮下、腹腔內、鼻腔內、腸道、局部、舌下或直腸內的給藥,但并不僅限于此。

    本發明的藥學組合物可根據如上所述的給藥路徑制成口服用或非口服用的制劑。

    口服用制劑的情況下,本發明的組合物為粉末、顆粒、片劑、丸劑、糖衣片劑、膠囊劑、液劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、懸浮液等,可使用本領域公知的方法劑型化。例如,口服用制劑可將活性成分與固體賦形劑摻合,將其粉碎并添加合適的助劑后,用顆粒的混合物進行處理,從而獲得片劑或糖衣片劑。作為合適的賦形劑的例子,可包括包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇和麥芽糖醇等的糖類,包含玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉和馬鈴薯淀粉等的淀粉類,包含纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基甲基纖維素等的纖維素類,明膠、聚乙烯基吡咯烷酮等填充劑。此外,可根據情況添加交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或海藻酸鈉作為崩解劑。另外,本發明的藥學組合物可還包含抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑和防腐劑等。

    非口服用制劑的情況下,可以注射劑、霜劑、洗劑、外用軟膏劑、油劑、保濕劑、凝膠劑、氣溶膠和鼻腔吸入劑的形式,通過本領域公知的方法制劑化。這些劑型在任何制藥化學上一般公知的處方書中有記載。

    本發明的組合物的總有效量可按照單次給藥量(singledose)給予患者,也可通過按照多次給藥量(multipledose)長期給藥的分次治療方法(fractionatedtreatmentprotocol)進行給藥。本發明的藥學組合物可根據疾病的程度改變有效成分的含量。優選地,本發明的藥學組合物的優選的整體容量每天每1kg患者體重為約0.01μg至10,000mg,最好是0.1μg至500mg。但是,關于所述藥學組合物的容量,考慮給藥途徑和治療次數以及患者的年齡、體重、健康狀態、性別、疾病的嚴重程度、飲食和排泄率等各種因素確定患者的有效給藥量,所以考慮這一點時,如果是擁有本領域常識的人,應可確定本發明的組合物的合適的有效給藥量。本發明所述的藥學組合物只要顯示本發明的效果,對其劑型、給藥途徑和給藥方法無特別限定。

    本發明提供一種包含所述抗體的干細胞的分化誘導用組合物。

    本發明的所述“干細胞”是具有可分化為各種各樣的細胞的干性(stemness)的未分化細胞的總稱,干細胞根據特定的分化因子和/或環境進行向特定細胞的分化。干細胞的種類有胚胎干細胞(embryonicstemcell)、胚生殖細胞、成體干細胞、癌干細胞等??衫酶杉毎委煋p傷組織的再生、糖尿病、白血病、帕金森氏癥、心臟病、脊髓外傷等各種疾病,本發明中最好是可以為來源于脂肪的間充質干細胞。

    本發明提供一種包含所述干細胞的分化誘導用組合物的干細胞用培養基。

    本發明的“干細胞用培養基”是包含含有所述c-met抗體的干細胞的分化誘導用組合物的培養基,是包含培養干細胞或使其分化的成分的培養基。所述培養基包括可使干細胞分化為脂肪、軟骨、骨、神經等所有細胞的培養基,較好是可以為使干細胞分化為脂肪細胞、軟骨細胞或骨細胞的培養基。

    本發明的一個實施例中,使用人重組c-met抗體進行人scfv文庫篩選,獲得擴增的樣品后,通過elisa方法確認結合能力,篩選顯示結合信號的樣品進行堿基序列分析。接著,選擇其中具有不同序列的候選(hit),通過elisa方法確認結合能力,篩選最強力結合的10個候選并轉換為人igg形態(參照實施例1、圖1a、圖1b和圖2)。

    本發明的另一實施例中,為了確認人igg與天然c-met結合而通過質粒轉染293f細胞后,回收細胞,用蛋白質a珠粒純化抗體并進行sds-page,結果確認所述10個候選(hit)轉換為人igg形態在細胞中表達,并且確認了輕鏈和重鏈的尺寸。接著,使用c-met陽性細胞進行了流式細胞分析后,篩選了抗體的結合圖案(bindingpattern)在細胞上呈現的最大變化與c-met的表達水平一致的4種抗體(參照實施例2、圖3、圖4a和圖4b)。

    本發明的又另一實施例中,使作為抗原的人c-met重組蛋白質固定于生物表面(biosurface)后,使抗體(a8、a11和c8)流過而與抗原反應后,測定結合系數,以octet平臺進行分析后,結果確認與所有以往的c-met抗體相比,3種抗體均具有高親和性和解離值(參照實施例3和圖5)。

    本發明的又另一實施例中,培養c-met陽性的細胞株而獲得蛋白質后,通過蛋白質印跡法確認了c-met的信號圖案,結果確認僅h596細胞株中未發生c-met催化的磷酸化,對h596細胞用hgf用不同濃度處理后進行了蛋白質印跡,結果確認tyr1234和tyr1349的表達量依賴于濃度而增加。然后,對h596細胞用hgf和作為c-met抗體的a8、a11、b10、c8按照不同濃度處理并進行了蛋白質印跡,結果確認hgf、a8、a11誘導包括如p-erk和p-akt等主要的下游信號的磷酸化信號(參照實施例4和圖6a~圖6c)。

    本發明的又另一實施例中,對h596細胞改變hgf、a8或a11的濃度以wst測試法分析了細胞增殖,結果確認以抗體處理的情況呈現與以hgf處理的情況不同的細胞增殖速度,但飽和點更高(參照實施例5和圖7)。

    本發明的又另一實施例中,使用沒有hgf的培養基和分別含有不同濃度的hgf、a8或a11的培養基培養間充質干細胞,培養的同時對培養時間、生存力和細胞形態進行了觀察,結果確認所有組均顯示細胞的平均生存率在90%以上,由此c-met抗體對干細胞的培養形態不造成影響(參照實施例6-1、圖8a和圖8b)。

    本發明的又另一實施例中,以hgf、a8或a11處理培養來源于脂肪的間充質干細胞后,誘導脂肪、軟骨和骨的分化。根據分化的細胞系分別以不同的培養基條件誘導干細胞的分化,對各細胞進行染色并觀察后,結果確認干細胞在所有的培養條件下分化為脂肪細胞,無hgf的培養基中未顯示軟骨和骨的分化,a8或a11顯示與hgf類似的結果。由此,確認干細胞中a8或a11具有與hgf同樣的作用(參照實施例6-2和圖a~圖9d)。

    此外,本發明還提供一種所述抗體或其片段在癌的預防或治療用制劑的制造中的用途。

    此外,本發明還提供一種癌的治療方法,其中,包括將有效量的包含所述抗體或其片段作為有效成分的組合物給予有需要的個體的步驟。

    本發明提供所述抗體在干細胞的分化誘導用制劑的制造中的用途。

    本發明提供一種干細胞的分化誘導方法,其中,包括將有效量的包含所述抗體的組合物給予有需要的個體的步驟。

    本發明的所述“有效量”是指向個體給藥時顯示癌的改善、治療、預防、檢測、診斷或者癌的抑制或減少效果的量,是指顯示誘導干細胞的分化的效果的量。所述“個體”可以是動物,較好是哺乳動物,特別是包括人的動物,可以是來源于動物的細胞、組織、器官等。所述個體可以是需要所述效果的患者。

    本發明的所述“治療”概括性地表示改善癌或癌的癥狀,其可包括癌的治愈和實質上的預防、或狀態的改善,包括緩解和治療、或預防源自癌的一種癥狀或幾乎所有癥狀,但并不僅限于此。

    本發明的術語“包括(comprising)~”與“含有”或“以~為特征”同樣地使用,在組合物或方法中,不排除未記載的追加成分、要素或方法步驟等。術語“由~形成(consistingof)”是指排除未另行記載的追加要素、步驟或成分等。術語“必須由~形成(essentiallyconsistingof)”是指在組合物或方法的范圍內,除了所記載的成分要素或步驟之外,包括對其基本特性不造成實質上的影響的成分要素或步驟。

    發明的效果

    因此,本發明提供抗c-met激動劑抗體及其應用。本發明的方法可用于c-met抗體的檢測、利用抗體的干細胞分化的誘導、癌的治療或預防。

    本發明所用試劑和原料均市售可得。

    本發明的積極進步效果在于:

    附圖說明

    圖1a和圖1b表示使用人c-met重組蛋白質作為抗原(antigen)的基于噬菌體展示(圖1a)和elisa的篩選結果(圖1b)。

    圖2表示基于elisa的結果選擇的候選(hit)的結合程度的確認結果。

    圖3表示為了確認純化的抗體的重鏈和輕鏈的尺寸而進行sds-page的結果。

    圖4a和圖4b表示使用a549細胞和mda-mb-231細胞通過流式細胞分析確認10種c-met抗體的結合能力的結果(圖4a)、以及利用a549、h596和skbr-3細胞通過流式細胞分析確認c-met抗體(a8、a11、b10、c8)的結合能力的結果(圖4b)。

    圖5表示使用octet分析確認c-met抗體(a8、a11、b10、c8)的結合親和性的結果。

    圖6a~圖6c表示使用蛋白質印跡法以c-met陽性細胞株確認c-met信號圖案的結果(圖6a)、對h596細胞分別以不同濃度的hgf處理確認c-met信號圖案的結果(圖6b)以及對h596細胞以hgf和c-met抗體(a8、a11、b10、c8)處理確認c-met信號圖案的結果(圖6c)。

    圖7表示使用wst分析方法確認c-met抗體和hgf對細胞增殖造成的影響的結果。

    圖8a和圖8b表示確認hgf或c-met抗體(a8)對間充質干細胞的群體倍增時間(圖8a)和生存力(圖8b)造成的影響的結果。

    圖9a~圖9d表示確認hgf或c-met抗體(a8)對間充質干細胞的基于培養條件的培養形態(圖9a)和脂肪分化(圖9b)、軟骨分化(圖9c)和骨分化(圖9d)造成的影響的結果。

    具體實施方式

    以下,對本發明進行詳細說明。

    但是,下述的實施例示例本發明,本發明并不受到下述的實施例的限定。

    實驗方法

    試劑

    a549細胞株和mda-mb231細胞株從atcc(美國典型培養物保藏中心,americantypeculturecollection,usa)購入,h596細胞、skbr-3細胞從韓國細胞株銀行(koreancelllinebank,kclb)購入。來源于脂肪的間充質干細胞由xcelltherapeutics(首爾)提供。此外,間充質干細胞培養用培養基從xcelltherapeutics購入。用于篩選的抗原為受體的包含1~932個氨基酸(aminoacid,aa)的人c-met重組蛋白質,從北京義翹神州生物技術有限公司(中國)購入。此外,作為對照組,使用從艾博抗(abcam,美國)購入的抗c-met抗體。

    噬菌體展示

    使用人重組c-met蛋白質作為抗原,人scfv文庫用于與c-met的細胞外區域結合的候選(hits)篩選。將抗原被覆于濃度10μg/μl的免疫管(nunc,usa),以o/n培養并使其結合。對于免疫管和噬菌體用封閉緩沖液(pbst內3%牛乳)抑制活性。將噬菌體加入被覆有抗原的免疫管并使其結合,1小時后,用pbst清洗4次,用pbs清洗1次。用7~8分鐘使噬菌體溶出至100mmtea后,用tris-hcl(ph8)溶液中和。使溶出的噬菌體感染大腸桿菌,一部分在固體la平板中以o/n培養而確認輸出效價(outputtiter)。殘留噬菌體用輔助噬菌體(helperphage)再生,同樣的實驗重復3次。

    elisa篩選

    第4次圍欄培養(penning)后,將單一群落分別注入96孔板的150μl的含氨芐青霉素的sb。接著,用37℃振蕩培養器培養至培養基白濁。培養后,將培養液加入圓板并用1nmiptg誘導后,在30℃過夜培養。使用c-met重組蛋白質作為抗原,在elisa(康寧3690)以1μg/ml的濃度溶于pbs進行被覆,在4℃過夜培養。第二天,將注入了克隆的平板以3000rpm離心分離15分鐘。除去上清液并將顆粒在37℃用1×tes緩沖液再懸浮5~7分鐘后,添加0.2×tes緩沖液在4℃反應30分鐘而溶解細胞。將被覆有抗原的平板用150μl的tbst清洗3次,用3%脫脂奶抑制反應。從被溶解的細胞回收周質(periplasmic)提取物,在新的平板中用6%脫脂奶抑制反應1小時。接著,將溶液添加于被覆有抗原的平板,在室溫下恒溫培養1小時后,用tbst清洗3次。然后,添加抗hahrp二級抗體培養1小時后,用tbst清洗3次。然后,以30μl的tmb處理而開始反應后,使用1nh2so4抑制反應,在450nm進行檢測。

    堿基序列分析和igg轉換

    對所述elisa篩選中所選的候選的序列進行分析(cosmogenetech,韓國)。使序列分析和elisa篩選后所選的最終候選轉換為人igg。將scfv序列轉換為人輕鏈和重鏈的序列,使其與基于克隆的poptivectm-topo和pcdnatm3.3-topo(賽默飛世爾科技公司,usa)載體融合。然后,用midiprep(machereynagel,德國)擴增質粒。

    過表達和抗體純化

    將擴增的質粒用freestyleexpressionsystem(英杰公司,usa)進行瞬時表達。在三角燒瓶(康寧,usa)中用freestyle表達培養基(freestyleexpressionmedium)解凍freestyle細胞(freestylecell)并進行培養。培養至細胞達到3.0×106細胞/ml的濃度,每2~3天傳代培養,4次傳代培養后,用freestyletmmaxtransfection試劑(英杰公司,usa)轉染重鏈和輕鏈質粒。然后,在8%co2、37℃的條件下用振蕩機培養細胞。轉染后第7天回收細胞,獲得上清液并過濾。過濾后,在色譜柱(bio-rad,usa)上將上清液適用于mabselectsure蛋白質a珠粒(gehealthcare,usa)。接著,通過sds-page和考馬斯藍(coomassieblue)染色確認了尺寸。

    流式細胞分析

    利用a549、mda-mp231、h596和skbr-3細胞進行了流式細胞分析(flowcytometricanalysis)。對于細胞,用細胞解離用試劑(celldissociationbuffer,hyclone,usa)提取細胞后,用pbs清洗后,分離2.0×105個細胞加入管中。將抗體以1μg/管的濃度用含2%fbs的dbps(wellgene)溶液稀釋并添加于細胞,反應1小時。作為對照組,使用了商業用抗c-met抗體。接著,清洗細胞2次,用結合有fitc的二級抗體反應40分鐘。清洗3次后,用facsbdcalibur(bd、usa)進行了分析。

    octet分析

    octet服務由pallcorp,fortebio提供。使用帶有his標簽的人重組c-met蛋白質(北京義翹神州生物技術有限公司,中國)作為抗原。靶在生物表面被濃度20μg/ml的12個ni-nta傳感器捕獲。使用pbs作為配體緩沖液,使用1×fortebiokinetic緩沖液作為分析物緩沖液。配體固定后,使c-met、a8、a11和c8的抗體結合,分析kon和koff的值并評價了結合能力。

    細胞培養和抗體治療

    對h596細胞用含10%fbs和1%青霉素/鏈霉素(hyclone)的rpmi(wellgene)進行了培養。為了觀察抗體是否能夠誘導磷酸化信號,在6孔板中培養細胞。接著,為了去除fbs產生的信號干擾,用不含fbs的rpmi培養基過夜培養。第二天,除去培養基,用以不同濃度含有抗體或hgf的溶液處理1小時。

    蛋白質印跡

    如上所述培養細胞后,用含有ripa(biosesang)、蛋白質分解酶抑制劑(roche)和磷酸化酶抑制劑(roche)的溶解緩沖液回收細胞,用1ml注射器使細胞溶解。溶解后,將細胞以14000rpm離心分離15分鐘。然后,回收上清液并通過bca分析(賽默飛世爾科技公司)對蛋白質進行了定量。將上清液與5×樣品上樣緩沖液混合后,加熱10分鐘。接著,進行sds-page后,將蛋白質轉移至激活的pvdf(聚偏二氟乙烯,polyvinylidenedifluoride)膜(bio-rad)。用5%bsa抑制膜的活性并用一級抗體反應后,用結合有hrp的二級抗體反應。然后,在暗室中用ecl(安瑪西亞公司)進行了確認。

    細胞增殖分析

    將h596細胞在96孔板中以1.0×104細胞/孔的濃度過夜培養。第二天,除去培養基,用以39pm~10nm的濃度含hgf或抗c-met抗體的溶液進行了處理。接著,培養細胞72小時,將培養基置換為wst溶液(dogen)培養2~3小時。接著,用多功能讀板儀(tecan)在450nm進行了測定。

    實施例1:與c-met結合的scfv的篩選和鑒定

    為了確認與c-met結合的抗體,使用僅含細胞外結構域(aa,1-932)的人重組c-met抗體作為抗原,基于所述的方法進行了人scfv文庫篩選。使抗原結合于免疫管(immunotube)后,重復進行4個循環。

    其結果如圖1a所示,在第3個和第4個的循環中顯示輸出(output)增加,第3個和第4個的循環中得到的樣品通過elisa法確認結合力,其結果示于圖1b。此外,選擇與對照組板相比顯示信號的樣品后,分析堿基序列(sequencing),選擇其中具有不同序列的31個候選(hit),再進行elisa確認結合力,選擇最強力結合的10個候選(hit)。各候選基于elisa的結果命名為a8、a9、a11、b8、b10、c8、c9、d7、d12、e10。接著,將10個候選轉換為人igg形態(圖2)。

    實施例2:人igg形態的天然c-met結合程度的確認

    為了確認所述實施例1中制成的人igg與天然c-met的結合,如下進行了實驗。

    首先,按照所述實驗方法以質粒轉染293f細胞并培養7天。然后,回收細胞并用蛋白質a珠粒純化抗體,進行sds-page。

    其結果如圖3所示,確認所述實施例1中最強力結合的10個候選被轉換為人igg形態并在細胞中表達,確認了輕鏈和重鏈的尺寸。

    確認轉換igg后,基于ccle的信息選擇對于c-met呈陽性的細胞,按照所述實驗方法進行了流式細胞分析((flowcytometry)。

    其結果如圖4a所示,抗體的結合圖案顯示在a549細胞上呈現的最大變化與c-met的表達水平一致,篩選其中最相似的4種抗體并使用其他細胞株進行了相同的實驗。此時,h596細胞株為中間表達細胞株,skbr-3細胞株被用作陰性對照組。

    其結果如圖4b所示,顯示4種抗體(a8、a11、b10、c8)的結合圖案與c-met表達水平相關,作為c-met陰性細胞株的skbr-3細胞株中顯示并未明顯呈現結合遷移。其中,a11中,確認a549和h596細胞株與作為對照組的抗c-met抗體的表達圖案類似,skbr-3細胞株與作為對照組的抗c-met抗體的表達率一致。

    由此,確認所選的4種先導抗體(leads)對c-met受體具有特異性。

    實施例3:先導抗體(leadantibody)的結合親和性的分析

    基于確認所述實施例2中的抗體與天然c-met結合的結果使用顯示最高遷移的先導抗體(a8、a11和c8),如下進行了實驗。

    通過所述實驗方法,使作為抗原的人c-met重組蛋白質固定于生物表面(biosurface)后,使抗體流過而與抗原反應。接著,使用結合系數kon和解離常數koff計算作為親和性的定量值的kd。分析通過octet平臺進行。kon值越高,則抗體與配體結合越快,koff值越低,則解離越慢。kd值以kon與koff的比計算。

    其結果如圖5所示,顯示與3種抗體與現有的c-met抗體相比,3種抗體均具有更高的親和性和解離值。其中,a11具有0.0244nm的kd值,與抗c-met抗體相比,kon常數顯示10倍的差,koff值顯示10左右的差。

    由此可確認,與以往的c-met抗體相比,a11抗體與受體更快結合,更慢解離。

    實施例4:c-met抗體的效果

    上述實施例中,確認篩選的c-met抗體對信號傳遞造成影響,因此使用c-met陽性且依賴于hgf信號活性的細胞株,進行了如下的實驗。

    首先,對c-met陽性的各種細胞株(hs746t、h596、aspc1、mkn45、snu620、snu5)分別進行培養后回收蛋白質。然后,如上述實驗方法所述,進行蛋白質印跡,確認了c-met信號圖案。

    其結果如圖6a所示,顯示僅h596細胞株未發生c-met催化的磷酸化。

    在此,向h596細胞添加50、100、200、500ng/ml的hgf并通過相同的方法進行了蛋白質印跡。其結果如圖6b所示,顯示添加hgf后,tyr1234和tyr1349的表達量依賴于濃度增加。

    此外,在6孔板中用rpmi培養基(無血清)過夜培養h596細胞后,以納摩爾濃度用hgf和作為c-met抗體的a8、a11、b10、c8處理1小時。然后,回收細胞并如上所述進行了蛋白質印跡。

    其結果如圖6c所示,顯示hgf、a8、a11誘導包括如p-erk和p-akt等主要的下游信號的磷酸化信號,但b10和c8不會誘導。此外,以a11處理的情況下,顯示tyr1234、tyr1349的表達量依賴于濃度增加,誘導p-erk和p-akt的表達。

    實施例5:c-met抗體對細胞增殖產生的效果

    為了確認在所述實施例4中確認的c-met抗體的信號誘導對細胞直接造成的影響,如下進行了實驗。

    首先,在96孔板中培養h596細胞,將實施例4中誘導信號活性的hgf、a8或a11以0.039~10nm的濃度進行了處理。接著,將細胞再培養72小時,通過wst測試法分析了細胞增殖。數值與對照組(未處理,untreated)的細胞增加率成比例地計算。

    其結果如圖7所示,確認已hgf、a8或a11處理的情況下細胞增殖,顯示以a11抗體處理的情況下在高濃度下增殖能力與hgf相同??纱_認這是與所述實施例的octet實驗結果一致的傾向。

    實施例6:間充質干細胞的c-met抗體的效果

    為了確認作為c-met抗體的a8和a11在間充質干細胞中顯示與hgf同樣的效果,進行了如下的實驗。

    向6孔板中加入含生長因子的化學穩定的培養基并接種間充質干細胞。此時,使用無hgf的培養基和分別含有不同濃度的hgf、a8或a11的培養基。

    6-1:c-met抗體的細胞毒性效果

    通過所述實驗方法,對來源于脂肪的間充質干細胞以不同濃度的hgf、a8或a11進行處理,以除去了hgf的培養基進行了培養。培養的同時對培養時間、生存力和細胞形態進行評價,使用cedes細胞計數裝置(roche,usa),臺盼藍染色(trypanbluestaining)后使用計數法對群體倍增時間和生存力進行評價,細胞形態使用光學顯微鏡拍攝圖像并觀察。

    其結果如圖8a和8b所示,群體倍增時間在未處理hgf的情況與以hgf和c-met抗體a11進行處理的情況下未顯示顯著差異。此外,所有組中,顯示細胞的平均生存率在90%以上。

    由此,可確認作為c-met抗體的a8對干細胞的培養形態不造成影響,具有與hgf同樣的效果。

    6-2:c-met抗體對干細胞的分化產生的效果

    通過所述實驗方法,對來源于脂肪的間充質干細胞以各種調整用培養基培養至第9次傳代。第9次傳代后將細胞接種于6孔板,使其根據分化的細胞系統生長。將細胞誘導為脂肪、軟骨和骨的分化。

    首先,通過如下的方法分化為脂肪細胞。第10次傳代的細胞生長至約90~100%,將培養基替換為細胞分化用培養基。使用stempro脂肪生成分化試劑盒(賽默飛世爾科技公司,usa)作為分化培養基,每2~3天更換培養基并維持2~3周。在分化為脂肪后,為了觀察細胞,以油紅o染色進行觀察。

    此外,通過如下的方法使干細胞分化為軟骨細胞。第10次傳代的細胞生長至約50%,將培養基替換為細胞分化用培養基。使用含fbs(hyclone,usa)、1%its-x、50μg/ml抗壞血酸、100nm地塞米松(dexamethasone)和10ng/mltgf-β1的dmem低葡萄糖培養基(wellgene,韓國)作為分化培養基,每2~3天更換培養基并維持2~3周。3周后,固定細胞并用阿爾辛藍(alcianblue)染色觀察。

    此外,通過如下的方法使干細胞分化為骨細胞。將細胞培養至第10次傳代,將培養基替換為細胞分化用培養基。使用含fbs、100nm地塞米松(dexamethasone)、10nm甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphate)、50μg/ml抗壞血酸和1%谷氨酰胺(glutamax)的dmem低葡萄糖培養基(wellgene,韓國)作為分化培養基,每2~3天更換培養基并維持3周。3周后,固定細胞,用茜素紅染色觀察。

    其結果如圖9a~圖9d所示,顯示干細胞在所有培養基條件下分化為脂肪細胞,但軟骨和骨分化在無hgf的培養基中未分化。此外,顯示用含有a11的培養基培養的細胞以與hgf對照組類似的密度被染色。

    由此可確認,為了維持干細胞的多分化能力,hgf發揮重要作用,a11在干細胞中發揮與hgf同樣的作用。

    工業上利用的可能性

    如上所述,本發明提供抗c-met激動劑抗體及其應用。本發明的方法可有效地用于c-met抗體的檢測、利用抗體的干細胞分化的誘導、癌的治療或預防。

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    <110>首爾大學校產學協力團

    璦備恩有限公司

    <120>抗c-met激動劑抗體及其應用

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