<input id="i6gg6"><blockquote id="i6gg6"></blockquote></input>
  • <sup id="i6gg6"><rt id="i6gg6"></rt></sup>
    <blockquote id="i6gg6"></blockquote>
  • <blockquote id="i6gg6"></blockquote>
  • <dd id="i6gg6"><blockquote id="i6gg6"></blockquote></dd>
  • <blockquote id="i6gg6"><small id="i6gg6"></small></blockquote>

    用于紅薯粉條中木薯特異基因檢測的LMCP引物組的制作方法

    文檔序號:25494294發布日期:2021-06-15 22:23
    用于紅薯粉條中木薯特異基因檢測的LMCP引物組的制作方法
    本發明涉及用于紅薯粉條中木薯特異基因檢測的lmcp引物組,屬于生物分子檢測
    技術領域
    。
    背景技術
    :紅薯(又名紅苕、甘薯、地瓜、山芋等)是一種古老的薯類作物,種植過程中無農藥污染,低化肥使用,是消費者最放心的綠色食品原料之一。紅薯富含蛋白質、淀粉、維生素及多種礦物質,并有防癌、通便、養顏、益壽等功效,被譽為“天然綠色食品”和“長壽食品”,居綠色蔬菜之首。近些年來,紅薯越來越多地被認作為保健食品,市場消費需求不斷增加。隨著人民生活水平的不斷提高和飲食休閑文化欣然興起,紅薯已經上升為食品工業的主要優質原料,在國際上享有盛譽,這也給中國的紅薯粉條產業帶來了巨大的市場契機。粉條是我國人民喜食的傳統食品之一,具有食用方便、快捷、營養合理和口味豐富等特點,受廣大消費者的喜愛和歡迎。其中紅薯粉條始終伴隨人們的日常飲食,其營養價值和適宜口感深受喜愛。但是現在的粉條市場存在很多問題,由于玉米淀粉、木薯淀粉的價格比紅薯淀粉低很多,所以有很多不法商人為獲取假貨帶來的暴利而向粉條中添加玉米淀粉、木薯淀粉,用玉米淀粉制作所謂的“純紅薯粉條”,為讓色澤形似、口感筋道,甚至添加墨汁和工業用料石蠟等違規添加劑。因此鑒別“紅薯粉條”的真假具有極其重要的意義。目前為檢測紅薯粉條中含有的有害物質以及判斷其真假,已經有很多種方法被建立,但尚未建立從基因的角度檢測紅薯粉條中是否存在木薯特異基因的方法,對于鑒別是否用其他淀粉制假紅薯粉條而言,基因檢測方法具有時間短,特異性強,靈敏度高等特點,極具研究價值和意義。技術實現要素:針對上述現有技術,本發明擬采用最新的核酸等溫擴增方法(梯度熔解曲線核酸等溫擴增,isothermalamplificationofnucleicacidswithladder-shapemeltingcurve,縮寫為lmcp,中國發明專利申請號:202011105405.3;pct申請號:pct/cn2020/133584;該專利申請目前尚未公開),設計lmcp引物,建立木薯源成分的快速檢測方法,為食品安全監管提供技術支撐。本發明提供了一套利用等溫擴增技術對木薯rrna特異基因片段檢測的引物組,用于檢測所抽提的粉條以及淀粉的dna,對市場上紅薯粉條的真實性起輔助識別作用。本發明是通過以下技術方案實現的:用于紅薯粉條中木薯特異基因檢測的lmcp引物組,包括以下兩條引物:p:5`-tgtccgagggtcttttttcacggctatcggtggttgg-3`;如seqidno.1所示;d:5`-gccgtgggcgaacttttggtcccgttcggcagac-3`;如seqidno.2所示。用于紅薯粉條中木薯特異基因檢測的試劑盒,包括上述lmcp引物組。上述lmcp引物組、試劑盒在檢測紅薯粉條中木薯特異基因中的應用。一種檢測紅薯粉條中木薯特異基因的方法:取待測樣品,抽提樣品dna,用上述引物組或試劑盒進行恒溫擴增;若擴增結果圖中出現指數曲線,則該樣品含有木薯rrna特異基因片段;若擴增結果中沒有出現特異梯狀譜帶,則樣品中不含有木薯rrna特異基因片段。進一步地,恒溫擴增核酸片段的方法包括以下步驟:(1)退火步驟:由于熔解溫度差異,引物p上的p1部分與模板上的互補序列退火;(2)鏈替代反應步驟:引物p在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條雙鏈,并取代下一條單鏈,其中取代下來的單鏈作為引物d的模板,在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增合成與步驟(1)相似的雙鏈,啟動新一輪擴增;(3)退火步驟:由于熔解溫度差異,引物p上的p1部分與步驟(2)合成的雙鏈模板上的互補序列退火;(4)鏈替代反應步驟:引物p在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條與步驟2相同的雙鏈,該雙鏈作為步驟(3)的模板啟動新一輪擴增,同時取代下來一條單鏈;(5)退火步驟:引物d上的d1部分與步驟(4)取代下來的單鏈退火;(6)合成反應步驟:引物d以步驟(5)的單鏈為模板在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條雙鏈;(7)退火步驟:由于熔解溫度差異,引物p上的p1部分與步驟(6)合成的雙鏈模板上的互補序列退火;(8)鏈替代反應步驟:引物p在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條雙鏈,同時取代下來一條與步驟(4)相同的單鏈,啟動新一輪擴增;(9)退火步驟:由于熔解溫度差異,引物p上的p1部分與步驟(8)合成的雙鏈模板上的互補序列退火;(10)鏈替代反應步驟:引物p在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條與步驟(8)相同的雙鏈,啟動新一輪擴增,同時取代下來一條單鏈;(11)指數擴增初始結構的形成步驟:由于自身的互補結構,步驟(10)取代下的單鏈形成頸環結構,此頸環結構即為指數擴增的初始結構。以步驟(2)替代下來的單鏈為模板的路徑如下:a.退火步驟:引物d上的d1部分與步驟(2)取代下來的單鏈退火;b.合成反應步驟:引物d以步驟(2)的單鏈為模板在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條雙鏈;c.退火步驟:由于熔解溫度差異,引物d上的d1部分與步驟b合成的雙鏈模板上的互補序列退火;d.鏈替代步驟:引物d在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條與步驟b相同的雙鏈,啟動新一輪擴增,并取代下一條單鏈;e.退火步驟:引物p上的p1部分與步驟d取代下來的單鏈退火;f.合成反應步驟:引物p以步驟d的單鏈為模板在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條雙鏈;g.退火步驟:由于熔解溫度差異,引物p上的p1部分與步驟f合成的雙鏈模板上的互補序列退火;h.鏈替代反應步驟:引物p在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條與步驟f相同的雙鏈,啟動新一輪擴增,并取代下一條單鏈;i.指數擴增初始結構的形成步驟:由于自身的互補結構,步驟h取代下的單鏈形成頸環結構,此頸環結構即為指數擴增的初始結構;以步驟(2)合成的雙鏈為模板的路徑如下:a’.退火步驟:由于熔解溫度差異,引物p上的p1部分與步驟(2)合成的雙鏈模板上的互補序列退火;b’.鏈替代反應步驟:引物p在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條與步驟(2)相同的雙鏈,啟動新一輪擴增,并取代下一條單鏈;c'.退火步驟:引物d上的d1部分與步驟b取代下來的單鏈退火;d’.合成反應步驟:引物d在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條雙鏈;e’.退火步驟:由于熔解溫度差異,引物p上的p1部分與步驟d合成的雙鏈模板上的互補序列退火;f’.鏈替代反應步驟:引物p在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條雙鏈,并取代下一條與步驟b相同的單鏈,啟動新一輪擴增;g’.退火步驟:由于熔解溫度差異,引物p上的p1部分與步驟f合成的雙鏈模板上的互補序列退火;h’.鏈替代反應步驟:引物p在dna聚合酶(大片段)催化下等溫擴增,合成一條與步驟f相同的雙鏈,啟動新一輪擴增,并取代下一條單鏈;i’.指數擴增初始結構的形成步驟:由于自身的互補結構,步驟h取代下的單鏈形成頸環結構,此頸環結構即為指數擴增的初始結構。作為進一步優選的技術方案,等溫擴增的溫度為53-65℃;等溫擴增的時間為10-60分鐘;所述等溫擴增的核酸片段為雙鏈dna、單鏈dna或rna中的任意一種。作為進一步優選的技術方案,所述dna聚合酶(大片段)為耐熱dna聚合酶(大片段),所述耐熱dna聚合酶(大片段)包括但不限于bstdnapolymerase(largefragment)或bsudnapolymerase(largefragment)或bsmdnapolymerase(largefragment)或φ29dnapolymerase或pfudnaplolymerase(largefragement)中的任意一種;當等溫擴增的核酸片段為rna時,所述dna聚合酶可用耐熱的rna逆轉錄酶代替(也可選用dna聚合酶,dna聚合酶在本發明的擴增體系中具有逆轉錄活性,也可用于本發明的rna的等溫擴增)。本發明的鑒別紅薯粉條中木薯基因的分子生物學方法,檢測速度快,可為糾正粉條市場亂象提供技術手段。本發明所引述的所有文獻,它們的全部內容通過引用并入本文,并且如果這些文獻所表達的含義與本發明不一致時,以本發明的表述為準。本發明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義。附圖說明圖1:核酸靶序列的tm值曲線圖。圖2:lmcp擴增溫度優化中52℃的擴增結果圖(graphtype:line)。圖3:lmcp擴增溫度優化中52℃的擴增結果圖(graphtype:log)。圖4:lmcp擴增溫度優化中52℃的擴增產物的熔解曲線。圖5:lmcp擴增絕對靈敏度測定的擴增結果圖(graphtype:line)。圖6:lmcp擴增絕對靈敏度測定的擴增結果圖(graphtype:log)。圖7:lmcp擴增絕對靈敏度測定擴增產物的熔解曲線圖。圖8:lmcp擴增相對靈敏度測定的擴增結果圖(graphtype:line)。圖9:lmcp擴增相對靈敏度測定的擴增結果圖(graphtype:log)。圖10:lmcp擴增相對靈敏度測定擴增產物的熔解曲線圖。圖11:lmcp特異性測定的擴增結果圖(graphtype:line)。圖12:lmcp特異性測定的擴增結果圖(graphtype:log)。圖13:lmcp特異性測定的擴增產物熔解曲線圖。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。然而,本發明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業人員能夠理解,在不背離本發明的精神和范圍的前提下,可以對本發明進行各種變化和修飾。下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等,若無特別說明,均為現有技術中已有的常規儀器、試劑、材料等,可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法,檢測方法等,若無特別說明,均為現有技術中已有的常規實驗方法,檢測方法等。實施例1引物設計及篩選(1)rrna基因上的its序列是被子植物系統發育研究中應用最廣泛的分子標記之一,可以用于植物物種鑒定,并且rrna基因在基因組上是多拷貝序列,選擇rrna基因為靶序列可提高檢測靈敏度,本實施例以木薯rrna(genbankid:mk114629.1)為靶標,選擇靶序上熔解曲線呈梯型的區域,用primer3plus軟件設計分別設計一對巢式引物,引物設計時將外引物的tm值范圍設定為59℃至61℃,長度為17bp至23bp,內引物的tm值不限,長度范圍為長度為12bp至16bp,將上游內引物的反向互補序列與上游外引物通過tttt接頭按5’-3’連接,將下游內引物的反向互補序列與下游外引物通過tttt接頭按5’-3’連接,連接后作為一對lmcp引物對靶序列擴增,,得到表1所示的13對引物(mushu1-1f1b1、mushu2-1f1b1、mushu2-1f2b2、mushu2-1f3b3、mushu2-1f4b4、mushu2-1f5b5、mushu3-1f1b1、mushu3-1f2b2、mushu3-1f3b3、mushu3-2f123b1、mushu3-3f123b1、mushu3-2f223b2、mushu3-3f223b2)。表1引物序列表對上述13對引物進行檢測,檢測方法為:按照表2配制反應體系,用steponeplus實時熒光定量pcr系統設置溫度梯度55℃、57℃、59℃、61℃,在四個不同溫度下等溫擴增60分鐘,每90s收集一次熒光信號,并測定熔解曲線,第一次設計的一套lmcp(mushu1-1f1b1)在四個溫度下陽性對照未擴增;第二次設計的五套引物(mushu2-1f1b1、mushu2-1f2b2、mushu2-1f3b3、mushu2-1f4b4、mushu2-1f5b5)在四個溫度下陽性對照未擴增;第三次設計的七套引物檢測結果如表3所示,三套引物(mushu3-1f1、mushu3-1f2b2、mushu3-1f3b3)在四個溫度下陽性對照未擴增,其他四套引物擴增,擴增效率最高的一套引物為mushu3-2f2b2,引物所對應的靶標的長度為66bp,靶標的tm值曲線如圖1(采用oligo引物設計軟件獲取)所示,選擇這套進行特異性與靈敏度測試,如果這套引物的特異性差,就按擴增效率順次進行其他三套引物的特異性與靈敏度測試,如果這套引物特異性強、靈敏度高就不再進行其他三套引物的測試。表2成分反應體系(10μl)bstdnapolymerasebuffer(10x)1.0μldna模板1.0μl引物p0.8μm引物d0.8μm甜菜堿(betaine)1.0m以上dmso5%左右(體積濃度)dntp1.2mm左右mgso44-6mmevagreen1×左右bstdnapolymerase(8u/μl)0.4μlnuclease-freewaterto10μl表3(2)采用引物mushu3-2f123b1,h2o為陰性對照,設置溫度56℃,57℃,58℃。結果如表4所示。表4分析:56℃,57℃,58℃下,h2o都不擴增,dna全部擴增。(3)采用引物mushu3-2f223b2,h2o為陰性對照,設置溫度54℃,55℃,56℃。結果如表5所示。表5分析:54℃,55℃,56℃下,h2o都不擴增,dna全部擴增。(4)溫度細化:采用引物mushu3-2f123b1,h2o為陰性對照,設置溫度55℃,56℃,57℃;結果如表6所示。表6分析:55℃,56℃,57℃下,h2o都不擴增,dna全部擴增。根據擴增效果,溫度選擇55℃。(5)采用引物mushu3-2f223b2,h2o為陰性對照,設置溫度52℃,53℃54℃,55℃。結果如表7所示。表7分析:52℃,53℃,54℃,55℃下,h2o都不擴增,dna全部擴增。根據擴增效果,選擇52℃。實施例2檢測紅薯粉條中木薯特異基因(1)反應體系(反應總體積為10μl)反應總體積為10μl,各成分及配比如表8所示。表8成分反應體系(10μl)bstdnapolymerasebuffer(10x)1.0μldna模板1.0μl引物p0.8μm引物d0.8μm甜菜堿(betaine)1.0m以上dmso5%左右(體積濃度)dntp1.2mm左右mgso44-6mmevagreen1×左右bstdnapolymerase(8u/μl)0.4μlnuclease-freewaterto10μl(2)溫度優化采用表8的反應體系,以木薯淀粉中提取的dna為陽性對照,模板加入量為1ng,以h2o為陰性對照,每個反應設置兩個重復,steponeplus實時熒光定量pcr系統設置溫度梯度51℃、52℃、53℃、54℃,在四個不同溫度下等溫擴增60分鐘,并測定熔解曲線。從熔解曲線判斷,四個溫度下均不存在引物二聚體引起的非特異性擴增,但52℃相對其他三個溫度擴增效率最高,20分鐘左右進入指數擴增階段(擴增結果如圖2、圖3和圖4所示),因此選52℃進行絕對靈敏度、相對靈敏度、特異性測定。(3)絕對靈敏度測定將木薯基因組dna分別稀釋為1ng、100pg、10pg、1pg和0.1pg測定所建方法的絕對靈敏度,采用表8的反應體系,以h2o為陰性對照,在steponeplus實時熒光定量pcr系統中52℃加熱60分鐘,并測定熔解曲線。結果如圖5、圖6和圖7所示,所建方法的絕對靈敏度為lpg,因此所建的木薯源性成分的lmcp檢測方法具有較高的靈敏度。(4)相對靈敏度測定在紅薯淀粉中分別添加5%、1%、0.1%和0.01%的木薯淀粉,提取dna,測定所建方法的相對靈敏度,采用表8的反應體系,以h2o為陰性對照,在steponeplus實時熒光定量pcr系統中52℃加熱60分鐘,并測定熔解曲線。結果如圖8、圖9和圖10所示,所建方法的相對靈敏度為0.01%,相當于10000公斤紅薯淀粉中添加1公斤木薯淀粉即可檢出,因此所建的木薯源性成分的lmcp檢測方法具有較高的靈敏度。(5)特異性測定采用木薯、紅薯、馬鈴薯、玉米,綠豆、小麥、大豆的基因組dna測定所建方法的特異性,基因組dna的加入量均為1ng,采用表8的反應體系,以h2o為陰性對照,每個反應設置兩個重復,在steponeplus實時熒光定量pcr系統中52℃加熱60分鐘,并測定熔解曲線。結果如圖11、圖12和圖13所示,只有加入木薯基因組dna的反應為陽性,其他反應均為陰性,因此,所建的木薯源性成分的lmcp檢測方法具有較高的特異性。實施例3粉條樣品檢測(1)采用引物mushu3-2f223b2,h2o為陰性對照,木薯dna1ng為陽性對照。溫度設置為52℃。31種粉條樣品dna使用試劑盒提取。體系如表9所示,結果如表10所示。表910微升buffer1.0dntp1.0sybr(50x)0.05bst0.05primer0.16+0.16dna1.0h2o5.33表10分析:木薯dna1ng和樣品3號,4號,8號,9號,10號,11號,14號,17號,18號,19號,21號,23號,30號擴增了。12號和24號有一條擴增。14號樣品重復性不好。(2)采用引物mushu3-2f223b2,h2o為陰性對照,木薯dna1ng為陽性對照。溫度設置為52℃。6號,16號,12號和24號樣品重新提取了dna。結果如表11所示。表11分析:h2o,6號,12號和16號樣品沒有擴增,木薯dna1ng,14號和24號樣品擴增了。上述雖然結合實施例對本發明的具體實施方式進行了描述,但并非對本發明保護范圍的限制,所屬領域技術人員應該明白,在本發明的技術方案的基礎上,本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。當前第1頁1 2 3 
    再多了解一些
    當前第1頁1 2 3 
    網友詢問留言 已有0條留言
    • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
    1
    色偷偷亚洲偷自拍视频_欧美色精品视频在线观看_欧美特黄特色三级视频在线观看_毛片免费全部播放无码